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Impacto del estrés térmico y del daño nuclear espermático en la viabilidad embrionaria y en la proporción de sexos en el ratón

Pérez Crespo, Miriam (2010) Impacto del estrés térmico y del daño nuclear espermático en la viabilidad embrionaria y en la proporción de sexos en el ratón. Tesis PhD.

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Abstract

El estrés térmico y la fragmentación del ADN espermático son dos factores muy influyentes
en la fertilidad de los animales domésticos. El estrés térmico afecta tanto a la calidad embrionaria
como a la calidad seminal. Sin embargo, en lo que respecta al desarrollo embrionario, no se
conoce con precisión cómo afecta a los estadios tempranos de desarrollo y si los embriones de
diferente sexo pueden responder de distinta forma al citado estrés. En cuanto a los gametos
masculinos, se conoce muy poco cómo el estrés térmico puede afectar la calidad espermática, y
las consecuencias que puede desencadenar en los embriones resultantes de la fecundación con
estos gametos. Uno de los parámetros a tener en cuenta cuando se habla de calidad espermática
es la fragmentación del ADN de los espermatozoides (una de las consecuencias del estrés
térmico); no se conoce de forma precisa la relación existente entre este parámetro y la capacidad
fecundante de los espermatozoides ni los efectos que para el desarrollo embrionario puede tener.
En este trabajo se planteó, en primer lugar, conocer cuáles son las diferencias en la
susceptibilidad al estrés térmico entre embriones de distinto sexo durante el desarrollo
preimplantacional y determinar cuáles son los mecanismos moleculares responsables de las
citadas diferencias; en segundo lugar, determinar cómo el estrés térmico puede alterar tanto el
desarrollo embrionario preimplantacional (in vivo e in vitro) así como la espermatogénesis,
utilizando como modelo experimental el ratón; y en tercer lugar, averiguar qué condiciones pueden
favorecer un aumento en el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado y las
consecuencias sobre el desarrollo embrionario y fetal, ya sea tras la utilización de la monta natural
o mediante una técnica de reproducción asistida, como es la inyección intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI). Para abordar estos objetivos, se diseñaron tres ensayos.
En el primer ensayo se analizó el efecto del estrés térmico sobre embriones producidos in
vitro e in vivo; utilizando, por una parte, embriones cultivados in vitro, y por otra parte, aplicando el
estrés térmico sobre las hembras en los primeros días de gestación (in vivo). En primer lugar se
analizó la supervivencia de los embriones de sexo masculino y femenino tras la aplicación del
estrés térmico in vitro, observándose un incremento en la supervivencia en los embriones de sexo
femenino. Otra de las diferencias observadas entre embriones de distinto sexo cultivados in vitro
bajo las citadas condiciones, fue su velocidad de desarrollo; los embriones de sexo masculino se
desarrollaron más rápidamente que los de sexo femenino. Con el fin de evaluar cuáles pueden ser
las causas de la diferente supervivencia entre embriones de distinto sexo, se procedió a
determinar la concentración relativa de peróxido de hidrógeno (H2O2) en embriones en estadio de
mórula sometidos a estrés térmico in vitro, y posteriormente se analizó el sexo de los mismos,
observándose que en los embriones de sexo masculino la concentración relativa de H2O2 era
superior a la observada en los embriones de sexo femenino sometidos al estrés térmico. Por otra
parte, otro grupo de embriones fue cultivado in vitro a 37ºC hasta el estadio de blastocisto,
determinándose el sexo de los mismos y la abundancia relativa del ARNm de genes importantes
Resumen
en el desarrollo embrionario. Se observó que la expresión de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6pdx), un gen ligado al cromosoma X y relacionado con el estrés oxidativo, era mayor en los
embriones de sexo femenino. Como hipótesis a contrastar, se planteó que la mayor supervivencia
de los embriones de sexo femenino en estadios de desarrollo temprano, ante situaciones de estrés
térmico, era debida a un aumento en la expresión G6pdx a diferencia de lo que ocurre en los
embriones de sexo masculino. Para evaluar el posible efecto protector frente al estrés térmico de
la actividad G6PD, se inhibió esta enzima a través de la utilización de dehidroepiandrosterona
(DHEA). Se comprobó que, tras la inhibición de G6PD, las diferencias inicialmente observadas
entre embriones de distinto sexo cultivados in vitro y causadas por el estrés oxidativo provocado
por el aumento de temperatura, desaparecían. Se demostró experimentalmente que G6PD
interviene en los mecanismos por los cuales los embriones de sexo femenino, en estadios
preimplantacionales, son más resistentes que los de sexo masculino ante situaciones de estrés
térmico.
En el segundo ensayo, se eligió también el estrés térmico como factor ambiental con
impacto sobre la fertilidad de los animales. En este caso, el estrés térmico fue aplicado de forma
local sobre los testículos de los ratones con el fin de evaluar el daño del estrés térmico sobre las
células germinales del testículo y los espermatozoides presentes en el epidídimo. En diferentes
momentos tras el tratamiento térmico (6 horas, 7, 14, 21, 28 días), se recogieron los
espermatozoides de la cola del epidídimo y del conducto deferente y se evaluaron diferentes
parámetros espermáticos. Paralelamente, se utilizó otro grupo de animales tratados para
establecer cruces con hembras en los momentos señalados después del estrés térmico;
adicionalmente, se evaluó el porcentaje de hembras gestantes, la tasa de implantación
embrionaria y el sexo de los fetos concebidos por estos machos. Los resultados indicaron que un
tratamiento térmico moderado y por un corto período de tiempo afecta de diferente manera a los
distintos tipos de células germinales masculinas, produciendo un incremento de la fragmentación
del ADN espermático en el período de 0 a 28 días después del estrés térmico. Cuando las células
dañadas fueron espermatocitos, los animales eran subfértiles. Sin embargo, los espermatozoides
formados a partir de las espermátidas afectadas mostraron los niveles más elevados de
fragmentación del ADN, sin que la fertilidad de los machos se viera alterada. Cuando los afectados
por el estrés térmico fueron los espermatozoides presentes en el epidídimo, observamos una
distorsión de la proporción de sexos de la descendencia a favor de las hembras.
En el tercer ensayo se persiguió como objetivo conocer los mecanismos implicados en la
fragmentación del ADN espermático y a la vez, establecer las consecuencias que sobre el
desarrollo embrionario y la fertilidad del individuo tiene la utilización, mediante ICSI, de muestras
espermáticas con un elevado grado de fragmentación del ADN. Para ello, las muestras de
espermatozoides recogidas de la cola del epidídimo y del conducto deferente fueron incubadas en
diferentes condiciones antes de la determinación de la fragmentación del ADN espermático. Las
condiciones elegidas fueron tres: a) un medio habitualmente utilizado para la manipulación de los
Resumen
embriones de ratón, medio M2; b) un medio llamado medio condicionado (MC), en el que se
encuentran todos los componentes (p.ej. endonucleasas) liberados por espermatozoides a los que
se les ha dañado su membrana plasmástica mediante congelación-descongelación, en ausencia
de crioprotectores y c) el medio MC suplementado con EDTA, quelante de Ca2+ y Mg2+, cofactores
esenciales para la actividad de las endonucleasas. Observamos que el porcentaje de
espermatozoides con ADN fragmentado es mayor en las muestras incubadas en MC respecto al
valor observado en el grupo control, sin embargo, este porcentaje no es diferente al del control
cuando los espermatozoides son incubados en MC suplementado con EDTA. En conclusión,
existen factores presentes en los medios que contienen espermatozoides con daño en su
membrana plasmática capaces de inducir fragmentación del ADN en espermatozoides tratados.
Estos factores necesitan la presencia en el medio de iones, como el Ca2+ o el Mg2+, para poder
actuar. Finalmente, las muestras incubadas en MC en las que habíamos observado un incremento
de la fragmentación del ADN espermático, se utilizaron para fecundar ovocitos mediante ICSI,
utilizando como control espermatozoides no incubados. Tras la realización de ICSI, se observó
que la incubación de los espermatozoides en MC no afectaba a la tasa de fecundación, ni al
número ni a la morfología de los blastocistos; sin embargo, la tasa de implantación se vio
significativamente reducida, lo que indicó un efecto negativo sobre la calidad embrionaria que se
manifiesta en estadios perimplantacionales. Concluimos que los factores liberados por
espermatozoides con la membrana dañada pueden, además de inducir fragmentación del ADN en
los espermatozoides tratados, reducir los porcentajes de implantación de los embriones
producidos con dichos espermatozoides.

Item Type:Thesis (PhD)
Additional Information:Tesis de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria, Departamento de Medicina y Cirugía Animal, leída el 21-05-2009
Directors:
DirectorsDirector email
Gutiérrez Adán , AlfonsoUNSPECIFIED
Uncontrolled Keywords:Ratones
Subjects:Medical sciences > Veterinary > Animal culture
ID Code:10383
Deposited On:25 Mar 2010 17:06
Last Modified:06 Feb 2014 08:42

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