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Mecanismo catalítico de la aril-alcohol oxidasa de "Pleurotus eryngii"

Hernández Ortega, Aitor (2012) Mecanismo catalítico de la aril-alcohol oxidasa de "Pleurotus eryngii". Tesis PhD.

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Abstract

Durante la degradación de la lignina por Pleurotus eryngii la enzima extracelular aril-alcohol oxidasa (AAO) genera el H2O2 que actúa como sustrato oxidante de las peroxidasas ligninolíticas y para la formación del radical hidroxilo. El poder reductor para la activación del O2 a H2O2 proviene de la oxidación de alcoholes aromáticos a los correspondientes aldehídos, siendo el alcohol p-metoxibencílico el sustrato natural de la AAO de P. eryngii. Esta oxidasa es una flavoenzima que contiene como cofactor una molécula de FAD unida de forma no covalente. Durante el presente trabajo se han estudiado en profundidad el mecanismo catalítico y las relaciones estructura-función de la AAO. Todo ello ha sido posible gracias a la disponibilidad de la estructura cristalográfica de esta oxidasa y de un protocolo de expresión heteróloga en Escherichia coli y activación in vitro de la enzima. El mecanismo catalítico de la AAO se estudió empleando sustratos αdeuterados y agua deuterada como solvente de la reacción. Durante la semi-reacción de reducción tiene lugar un proceso concertado (es decir, sin formación un intermediario estable) de transferencia de hidruro, desde el carbono-α del alcohol al N5 de la flavina, y de protón, desde el hidroxilo del alcohol a la base catalítica. Este mecanismo es diferente del mecanismo secuencial (no-concertado) observado en otras oxidorreductasas de la superfamilia GMC. Empleando las formas α-monodeuteradas del alcohol p-metoxibencílico se encontró que la transferencia de hidruro es un proceso estereoselectivo, que viene determinado por la posición del sustrato en el centro activo de la AAO. Debido a que se había observado previamente que la AAO es también capaz de oxidar algunos aldehídos aromáticos, se estudió en detalle la
oxidación de estos compuestos combinando diferentes técnicas
experimentales. Se observó que la enzima únicamente es capaz de oxidar aldehídos aromáticos en su forma gem-diol. Esta característica explicó por qué la presencia de sustituyentes electrofílicos en el anillo aromático (que
promueven la hidratación del carbonilo) favorecía la oxidación, y así mismo, explicó la diferente especificidad de la AAO por ambos tipos de sustratos (alcohol vs aldehído). Además, se postuló que el mecanismo de
oxidación de la forma gem-diol de los aldehídos es similar al mecanismo de oxidación de los alcoholes, donde participa una base catalítica, activando el sustrato a través de la abstracción del protón de uno de los grupos hidroxilo
de la forma gem-diol. Posteriormente, se combinaron técnicas experimentales y computacionales para investigar diferentes aspectos del mecanismo y las relaciones estructura-función en la AAO. En primer lugar se estudió la
migración del alcohol al centro activo, escasamente accesible desde el solvente, identificando los residuos que actúan como puerta de entrada del canal hidrofóbico de la enzima y aquellos que participan en el proceso de
migración (Tyr92/Phe397/Phe501). Una vez en el centro activo, el sustrato adoptó una posición catalítica coincidente con la identificada experimentalmente usando isómeros α-monodeuterados del alcohol, es decir, con el hidrógeno que se transfiere (pro-R) próximo al N5 de la
flavina. A través de los estudios de mutagénesis dirigida, estado de protonación y perfiles energéticos teóricos, se concluyó que la His502 actúa como la base catalítica responsable de la abstracción del protón del grupo hidroxilo del alcohol (facilitando la posterior transferencia de hidruro a la flavina) mientras que la His546 facilita el correcto posicionamiento del
sustrato en el centro activo. Los perfiles energéticos de la reacción obtenidos mediante simulaciones de mecánica quántica/mecánica molecular (QM/MM) mostraron que, a pesar de que la transferencia de protón e hidruro son procesos altamente acoplados (concertados), la abstracción del protón por la His502 es previa a la transferencia de hidruro
(mecanismo concertado no-sincrónico). También, se estudió la segunda semi-reacción del ciclo catalítico de la AAO. La migración del O2 mostró que esta molécula accede al centro activo a través del mismo canal hidrofóbico empleado por los alcoholes, pero en este caso sin que se requieran reajustes significativos de las cadenas laterales de los residuos del canal. Durante esta semi-reacción el oxígeno es primero reducido a anión superoxido mediante la transferencia de un electrón desde la flavina reducida. Durante esta etapa, la His502H+ actúa como acido, facilitando la formación y posterior estabilización del anión superoxido, mientras que el residuo Phe501 facilita el correcto posicionamiento del O2 junto al locus
C4a-N5 de la flavina. Esta semi-reacción incluye la transferencia de un segundo electrón desde la forma semiquinona de la flavina y dos protones desde el N5H y la His502 al anión superoxido dando lugar al H2O2 (aunque
sólo la primera transferencia es parcialmente limitante en la reoxidación). Finalmente se encontró que la estereoselectividad de la AAO en la transferencia de hidruro desde la posición pro-R en el carbono-α del
alcohol (mostrada utilizando los enantiómeros (R) y (S) del alcohol pmetoxibencílico α-deuterado) se mantiene durante la oxidación de alcoholes secundarios por la enzima nativa, y especialmente por la variante F501A con el centro activo ampliado. Este resultado (confirmado mediante cromatografía quiral) revela el interés biotecnológico de esta oxidasa no
solo por su contribución en la degradación de la lignina y la síntesis de aromatizantes, sino también por su mecanismo de oxidación.

Item Type:Thesis (PhD)
Additional Information:Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, leída el 25-05-2012
Directors:
DirectorsDirector email
Ferreira Neila, PatriciaUNSPECIFIED
Martínez, Ángel TUNSPECIFIED
Uncontrolled Keywords:Enzimas
Subjects:Medical sciences > Biology > Molecular biology
ID Code:16726
Deposited On:16 Oct 2012 09:01
Last Modified:07 Feb 2014 09:34

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