Publication: Asociación de las subunidades de PI3-cniasa de clase IA a ICOS (CD278) y su importancia en la coestimulación
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2013-04-11
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Universidad Complutense de Madrid
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Abstract
ICOS es una molécula coestimuladora expresada en linfocitos T activados; comparte con CD28 un motivo citoplasmico (YxxM), importante en la señalización celular por ser potencialmente capaz de asociar las subunidades reguladoras de PI3-cinasa. Puesto que hay una diversidad de subunidades catalíticas en las PI3-cinasas de clase IA (α, β, δ), con importantes diferencias en su expresión y –posiblemente- en sus funciones, hemos analizado la asociación de las distintas subunidades de PI3-cinasa a ICOS.
En este trabajo se analizaron por ensayos de “pull-down” aquellas proteínas de lisado de células SR.D10, linfocitos T CD4+ y linfoblastos capaces de unirse a péptidos de ICOS fosforilados en el residuo de tirosina (ICOSpTir) y a inmunoprecipitados de ICOS. Los péptidos ICOSpTir asocian las subunidades reguladoras de PI3-cinasa (p85α, p85β, p50-55α) y las subunidades catalíticas (p110α, p110βy p110δ). Por ensayos de “inmunoblot” se encontró una asociación preferencial de la subunidad catalítica p110αa péptidos ICOSpTir pero también a inmunoprecipitados de ICOS. Además, al inmunoprecipitar PI3-cinasa con anticuerpos frente a la subunidad reguladora se observó una unión preferencial de la subunidad p110αa la subunidad reguladora, explicando la asociación preferencial de esta subunidad a ICOS. Como se ha postulado una importancia funcional preferente de la subunidad catalítica p110δen la activación de linfocitos T, se han analizado las funciones de ambas subunidades p110αy p110δen la coestimulación por ICOS.
Al estudiar la fosforilación de Akt y la producción de citocinas inducida por anti-CD3 y anti-ICOS en diferentes tipos celulares observamos una diferente sensibilidad de los residuos Ser473 y Tre308 de Akt al utilizar inhibidores dirigidos a diferentes subunidades catalíticas p110, confirmando la importancia de estas subunidades en la activación de Akt. Así, en células SR.D10 la activación temprana de Akt (Ser473), fue bloqueada parcialmente al inhibir las subunidades catalíticas p110αy p110δde PI3-cinasa con siARN o con inhibidores farmacológicos; en blastos de linfocitos T CD4+, la fosforilación en la Treonina 308 de Akt fue inhibida eficientemente por inhibidores de p110α(A66), p110(IC87114), o de todas las isoformas (LY294002), mientras que la fosforilación en la Serina 473 fue inhibida parcialmente por el inhibidor de p110α(A66), y totalmente por el de p110δ, o por LY294002. Estos resultados confirman la importancia de estas subunidades en la activación de Akt. En cuanto a la secreción de citocinas encontramos que la producción de IL-4 e IL-10 es dependiente de la vía PI3-cinasa/Akt en células SR.D10, ya que el inhibidor general de PI3-cinasa (LY294002) y de las subunidades catalíticas p110αy p110δinhiben la secreción de estas citocinas En blastos no se observó un efecto significativo sobre la producción de IL-4 o IL-10, pero si sobre la producción de IFN-γ con concentraciones más bajas de los dos inhibidores de p110α La asociación preferente de las subunidades catalíticas p110αa las subunidades reguladoras de PI3-cinasa no es específica de la región citoplasmática de ICOS, también pudimos observarla asociada a un péptido de CD28 fosforilado en su motivo YxxM. Al analizar el papel de p110αen la coestimulación por CD28 encontramos que, a concentraciones de 1-0,1 μM, el inhibidor de p110α(PIK-75) inhibía completamente la proliferación a tres días y la producción de citocinas como IL-2 o IFN-γ. Sin embargo, observamos que esta inhibición estaba acompañada por una fuerte pérdida de viabilidad en las células a partir de las 24 horas de cultivo. El uso de inhibidores y el silenciamiento de la subunidad catalítica p110α confirmaron la importancia de esta subunidad en la supervivencia de linfocitos T. Además, la muerte celular inducida por PIK-75 es dependiente de caspasas en linfocitos T CD4+ pero no en la línea celular SR.D10. También demostramos que la ligación de ICOS induce elongación celular y gránulos densos o puntos de actina polimerizada que se encuentran muy cerca de la superficie de contacto célulacristal; estos cambios morfológicos son dependientes de PI3-cinasa, en especial de la subunidad catalítica p110α. Los cambios en el citoesqueleto de actina inducidos por ICOS son dependientes de Vav, de las GTPasas Rac-1 y Cdc42, y de la cinasa de la cadena ligera de miosina (MLCK), pero independientes de la vía de Akt o de ROCK. ICOS incrementa el agrupamiento de balsas lipídicas inducida por anticuerpo anti-CD3 en el sitio de contacto con el estímulo. Sin embargo, ICOS, es indetectable en las balsas de membrana, incluso empleando ligandos (CD3 o ICOS) capaces de inducir cambios claros en el citoesqueleto de actina. En conjunto, en este trabajo resaltamos la importancia de PI3-cinasa de clase IA en la coestimulación de ICOS; no solo confirmamos la importante función de la subunidad catalítica p110δ, sino que también atribuimos un papel dominante a la subunidad catalítica p110α, que la convierte en una nueva diana potencial en la terapéutica inmunomoduladora. La investigación adicional de los modelos de ratón seguirá aportando pistas sobre los posibles beneficios y retos de una terapia dirigida a p110αde PI3-cinasa.
Description
Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Fisiología (Fisiología Animal II), leída el 17-01-2013