Publication: Derivados lipídicos biocompatibles: una mejora en la vectorización del DNA
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2015-08-06
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Universidad Complutense de Madrid
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Abstract
En esta tesis doctoral se ha llevado a cabo una amplia caracterización biofísica y bioquímica de distintos vectores lipídicos, con el objetivo de encontrar agentes de transfección que ofrezcan altos rendimientos y bajos niveles de toxicidad. Para ello, se han caracterizados diversos lípidos catiónicos gemini (GCLs) constituidos por grupos catiónicos de diversa naturaleza (lisina, amonio e imidazol) unidos a cadenas hidrofóbicas de variada longitud y grupos espaciadores de diferente naturaleza (cadenas alquilicas o con oligooxietilenos). De igual forma, se han caracterizado dos lípidos aniónicos (ALs) en presencia de entidades catiónicas di yo multivalentes, así como de vectores supramoleculares como el calixareno TMAC4. Como lípido coadyuvante, se ha utilizado en cada sistema el lípido zwitteriónico DOPE. Con el fin de comprender un poco más las interacciones de los vectores no virales con los fluidos biológicos, adicionalmente se ha llevado a cabo un estudio de la evolución temporal de la corona de proteínas adsorbida sobre la superficie del vector formado por el lípido catiónico DC Chol y DOPE. La caracterización biofísica y bioquímica se ha realizado mediante diferentes técnicas, potencial zeta electroforesis en gel de agarosa, anisotropía de fluorescencia, crio TEM, SAXS, MCF, FACS. Adicionalmente, para la caracterización de la corona de proteínas se han utilizado SDS PAGE y nanoLC MSMS. Los resultados encontrados, indican que los estudios electroquímicos han sido fundamentales para determinar las composiciones óptimas de compactación del plásmido (pDNA). Se ha encontrado en todos los casos que el pDNA presenta una menor carga efectiva respecto a su carga nominal. De los estudios estructurales llevados acabo mediante crio TEM, se ha encontrado que los lipoplejos pueden llegar a formar una rica variedad de nanoestructuras multilamelares, que van desde estructuras tipo ribbon type, así como estructuras tipos cluster type y fingerprint. Por otra parte, los estudios de SAXS confirmaron que las estructuras encontradas por crio TEM presentaban principalmente un ordenamiento tipo lamelar, mientras que para los lípidos aniónicos a ciertas composiciones de DOPE se encontró un ordenamiento tipo hexagonal. Es de destacar que en algunos casos se encontró una coexistencia de dos fases lamelares, lo cual parece provocar un efecto sinérgico potenciador de la eficiencia de transfección. Los estudios de transfección de los diferentes sistemas caracterizados en esta tesis doctoral han permitido determinar que los vectores formados por GCLs son mejores que los formados por ALs. Dentro de los lípidos catiónicos GCLs, los lipoplejos formados por GCL con C quirales, que dan lugar a estructuras tipo ribbon type, no produjeron niveles significativos de transfección. Por otra parte, los GCL con oxígenos en su grupo espaciador, presentaron muy buenos niveles de TE, superiores a los del control Lipofectamina. Por otra parte, Cx mostró niveles de transfección comparables a los del control Lipofectamina2000, pero nunca superiores a los obtenidos para los GCL con espaciador oxietileno. En todos los casos, se encontró que la presencia del lípido zwitteriónico DOPE favorece la eficiencia de transfección; de ésta forma, las mejores TE se obtuvieron, en general, a bajas composiciones de CL o AL (¿ = 0.2). Finalmente, la caracterización de la evolución temporal de la corona de proteínas formada sobre un vector de transfección modelos (DC CholDOPE), cuando éste es incubado en suero humano, mostró que dicha corona se forma rápidamente, y que su composición es dependiente del tiempo. Un mayor tiempo de incubación favorece la aparición de proteínas del tipo de las dis opsoninas, como las apoliproteínas, las cuales aumentan el tiempo de circulación del nanovector en la sangre, e inducen una mejora en la capacidad de internalización del nanovector en las células.
Description
Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Químicas, Departamento de Química Física I, leída el 21-05-2015