Publication: Estudio de las β-glucosidasas del complejo celulítico de "Talaromyces amestolkiae": caracterización y aplicaciones biotecnológicas
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2015-09-02
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Universidad Complutense de Madrid
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Abstract
La celulosa es la fuente de energía más abundante que hay en la Tierra. Su transformación en glucosa se considera la etapa más importante en la producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica. Para esta transformación es necesaria la acción sinérgica de tres tipos de enzimas que hidrolizan los enlaces ß-1,4 de la celulosa: (i) las endoglucanasas, que actúan al azar sobre enlaces internos, (ii) las celobiohidrolasas, que operan progresivamente por los extremos reductores y no reductores de la cadena, y (iii) las ß-glucosidasas (BGL), que hidrolizan celobiosa y los celooligosacáridos más pequeños hasta glucosa. Los hongos filamentosos son la principal fuente de celulasas, siendo los crudos del género Trichoderma los más estudiados y comercializados históricamente. Sin embargo, estos hongos secretan niveles insuficientes de BGL para una conversión efectiva de la celulosa, por lo que con frecuencia requieren ser suplementados con preparaciones ricas en esta enzima procedentes de otros hongos. Recientemente, se han descrito cepas de Penicillium con gran capacidad para secretar altos niveles de BGL al medio extracelular. Además de su papel en la hidrólisis de la celulosa las BGL también pueden emplearse para sintetizar compuestos de interés industrial mediante reacciones de transglicosilación. En este trabajo se ha estudiado una nueva cepa fúngica productora de celulasas, identificada como Talaromyces amestolkiae, en base a un análisis molecular y morfológico. Se han purificado a homogeneidad electroforética tres BGL (BGL-1, BGL-2 y BGL-3) secretadas por el hongo y se han caracterizado bioquímicamente. BGL-1 y BGL-2 son proteínas monoméricas, mientras que BGL-3 es un dímero funcional. Los valores de actividad máxima de estas enzimas se obtuvieron a pH 4,0 y entre 50-60 ºC, siendo estables en un rango de pH de 4-7 y a 50 ºC. Las tres mostraron distinto comportamiento en función del sustrato (pNPG o celobiosa), ensayándose también el efecto de determinados compuestos químicos e inhibidores en su actividad. Las tres pueden hidrolizar celooligosacáridos de diferente longitud, disminuyendo la eficacia de hidrólisis con el aumento de la polimerización, y no son activas frente a polisacáridos. Además, mostraron actividad de transglicosilación, formando alquilglicósidos y celooligosacáridos de mayor longitud que los usados como sustratos. Las tres BGL se identificaron mediante huella peptídica y en base la alta homología con otras BGL fúngicas relacionadas filogenéticamente, se diseñaron cebadores específicos que permitieron la secuenciación de los genes que codifican cada una de ellas. El análisis de las secuencias aminoacídicas mostró que BGL-1 es miembro de la familia 1 de las glicosil hidrolasas, mientras que BGL-2 y BGL-3 pertenecen a la familia 3. Teniendo en cuenta que existen pocas BGL fúngicas cristalizadas, se construyeron modelos moleculares de estas últimas en base a las estructuras con las que presentaron mayor identidad. El crudo enzimático de T. amestolkiae, rico en BGL, se usó de forma individual y como suplemento de otros cócteles comerciales en experimentos de sacarificación a partir de slurry ácido de paja de trigo. Los resultados obtenidos indican que el hongo secreta, además de celulasas, otras enzimas complementarias que potencian la liberación de azúcares fermentables. Se analizó el secretoma de T. amestolkiae usando Avicel o slurry ácido de paja de trigo como fuente de carbono. Las celulasas fueron las enzimas más abundantes en ambas condiciones, sin embargo, en el crudo obtenido a partir de los cultivos en slurry aumentó la proporción de BGL y otras enzimas distintas a las celulasas, indicando que para la degradación de un sustrato complejo es necesaria mayor diversidad enzimática. Los resultados obtenidos en este trabajo abren nuevas vías para la formulación de cócteles enzimáticos eficaces en el contexto de la degradación de la biomasa lignocelulósica.
Description
Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, leída el 15-06-2015