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Modulación de la formación y de la diversidad estructural de amiloides

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Martínez Fernández, Javier Alberto (2016) Modulación de la formación y de la diversidad estructural de amiloides. [Thesis]

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Abstract

Desde su descubrimiento como deshecho celular hasta la actualidad, los amiloides han adquirido la denominación de estado estructural provisto de actividad funcional. La estabilización de este estado requiere la presencia en la cadena de regiones adhesivas o proamiloidogénicas capaces de formar una lámina β-cruzada, su reactivación por exposición al medio y una concentración superior a una umbral para contrarrestar la barrera entrópica asociada a la adquisición del orden fibrilar. Estos requisitos pefilan un proceso de formación en varias etapas que permite la existencia de factores reguladores tanto intrínsecos como extrínsecos. Dentro de estos factores, se encuentran las mutaciones metabólicas derivadas de la sustitución de Met por SeMet, los códigos contenidos en la estructura de la carga y los cambios drásticos de entorno que modulen la unión de ligandos. Para determinar el papel de la sustitución de Met por SeM, o mutación metabólica, en el ensamblaje de amiloides se eligieron regiones con uno (Aβ40, M35) o varios (HuPrP106-140; M109, M112, M129, M134) residuos. Estas secuencias y sus sustituciones se sintetizaron empleando métodos en fase sólida, y su capacidad para formar amiloides y la naturaleza de éstos se analizó utilizando cinéticas de unión de tioflavina T (ThT), electroforesis (PAGE-SDS), dicroísmo circular (CD), microscopía de fuerzas (AFM) y ensayos de citotoxicidad. En el caso de Aβ40, la sustitución de M35 por SeM impide la formación de fibras amiloides y da lugar a la formación de agregados no tóxicos tanto en reacciones de homo- ([SeM35]Aβ40 con [SeM35]Aβ40) como heteroasociación ([SeM35]Aβ40 con [M35]Aβ40). En el caso de HuPrP106-140, las distintas sustituciones generan un abanico de efectos entre los que se encuentran la inhibición (SeM129), la aceleración (SeM109 y SeM112), la reducción del rendimiento (SeM134), y cambios de forma, todos ellos correlacionados con alteraciones en la actividad citotóxica. Para determinar el papel de la estructura de las cargas en la formación de amiloides, se eligió la cadena de PrP, en la que ésta presenta una distribución peculiar. En esta cadena el dominio N-terminal repetitivo está flanqueado por dos regiones polibásicas CC1 (23-30) y CC2 (101-110), mientras que el dominio C-terminal contiene la totalidad de los residuos ácidos, algunos de ellos expuestos. Para determinar el papel de la carga superficial en la formación y propiedades del estado amiloide de PrP, se generaron a partir de HaPrP(23-231) wt los mutantes K2(K24E,K27E), K4(K101,104,106,110E), K6 (K2-K4), K2-E200K, E200K, Q217R, Q219K, E221K y PrPΔ23-89. Las cadenas producidas de forma recombinante se caracterizaron empleando dispersión dinámica de luz (DLS), CD, AFM y microscopía de fluorescencia, mientras que las expresadas en células CHO mediante transfección transitoria se utilizaron en ensayos de procesamiento. La caracterización de la forma α (tipo PrPC) indicó la existencia de un estado abierto y otro compacto más estable, cuya conversión depende de una interacción entre dominios, mediada por la región CC1 y la superficie electronegativa de α3. Esta interacción entre dominios dificulta la ruta de formación de amiloides. Por otra parte, la organización de la carga juega un papel clave en el estado amiloide, determinando su estructura y reactividad superficial...

Resumen (otros idiomas)

Since their discovery as protein deposits, amyloids have progressively evolved to achieve the features of a structural state exhibiting function. To form amyloids, proteins first must contain in their sequence regions with cross-β sheet folding capacity. Second, such region must become prone to aggregation by solvent exposure. And third, the concentration of reactive regions must be overcome a threshold to counteract the entropic barrier of fibril ordering. These basic requirements describe amyloid formation as a multistep process under the control of both intrinsic and extrinsic factors. Among them, metabolic mutations resulting from Met substitution by SeMet, charge codes and drastic environmental changes with ligand binding impact could play yet unknown roles. To gain insights the role of Met substitution by SeMet in amyloid assembly, the fibril-forming sequences of Aβ40 with one Met (M35) and HuPrP106-140 with several Met (M109, M112, M129, M134) were chosen. Sequences were synthesized using ad-hoc solid phase methods and their assembly properties analyzed using thioflavin T (ThT) binding kinetics, electrophoresis (SDS-PAGE), circular dichroism (CD), atomic force microscopy (AFM) and cytotoxicity assays. For Aβ40, substitution of M35 by SeM abrogated amyloid formation yielding non-toxic aggregates, both in homologous ([SeM35]Aβ40 with [SeM35]Aβ40) and heterologous ([SeM35]Aβ40 with [M35]Aβ40) reactions. For HuPrP106-140, single substitutions resulted in a variety of effects such as inhibition (SeM129), facilitation (SeM109 y SeM112), yield reduction (SeM134), and shape changes ape, all correlating with the cytotoxic activity. To address the role of possible codes contained in the structure of exposed charges in amyloid assembly PrP chain was chosen. This two-domain chain contains a peculiar charge structure, with an N-terminal domain flanked by two polybasic clusters (CC1, residues 23-30, and CC2, residues 101-110), and a C-terminal harbouring all acid residues some of which are solvent exposed. HaPrP(23-230) wt chains and its various charge mutants (K2(K24E,K27E), K4(K101,104,106,110E), K6 (K2-K4), K2-E200K, E200K, Q217R, Q219K, E221K and PrPΔ23-89) were produced recombinantly and characterized using dynamic light scattering (DLS), CD, AFM and fluorescence microscopy. Also, the different chains were expressed in CHO cells using transient transfection assays, and the products characterized using enzymatic deglycosylations and immunodetections. Study of the α-fold showed the existence of an open and a compact forms and that their conversion is mediated by the interaction between CC1 and the electronegative surface of α3 that also impedes fibrillation. In the amyloid state, charges dictated the structure, the growth and the surface reactivity. To analyze amyloid regulation by drastic environment changes with linked ligand binding effects, the dominant fish allergen Ca2+ binding Gad m1 and the simulated gastrointestinal transit were considered. Use of ThT binding, SDS-PAGE, CD, DLS, proteolysis and dot-blot assays showed that Gad m 1 forms amyloids from its apo form. Such form, stabilized both under gastric conditions or in the presence of chelates, forms amyloid depots which conferred protease resistance and yielded type 2 oligomers under intestinal conditions displaying the binding to allergic patient sera-contained IgE.

Item Type:Thesis
Additional Information:

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, leída el 16-12-2015

Directors:
DirectorsDirector email
Gasset Vega, María
Uncontrolled Keywords:Biología molecular
Palabras clave (otros idiomas):Molecular Biology
Subjects:Medical sciences > Biology > Molecular biology
ID Code:36314
Deposited On:10 Mar 2016 11:43
Last Modified:10 Mar 2016 11:43

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