Universidad Complutense de Madrid
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Estudio e interés biotecnológico de una esterasa versátil producida por un hongo del azulado de la madera

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Barba Cedillo, Víctor (2016) Estudio e interés biotecnológico de una esterasa versátil producida por un hongo del azulado de la madera. [Thesis]

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Abstract

Las lipasas y esterasas son biocatalizadores versátiles y el tipo más utilizado de enzimas para fines biotecnológicos. El hongo Ophiostoma piceae produce un esterol esterasa (OPE) con alta afinidad sobre triglicéridos y ésteres de esterol siendo capaz de hidrolizar eficazmente mezclas naturales de estos compuestos a partir de extractos de madera. Debido a estas propiedades, se ha propuesto el uso de esta enzima para disminuir el problema de la deposición de pitch en la fabricación de pasta de madera procedente de coníferas y frondosas. La secuencia de la proteína madura de la OPE se ha expresado con éxito en cepas Mut+ y Muts de Pichia pastoris, que difieren en su capacidad de metabolizar metanol como inductor de la expresión, dando como resultado niveles más altos de actividad que los obtenidos en cultivos en Erlenmeyer de O. piceae. Además, la producción de la enzima recombinante (OPE*) se escaló a biorreactor operando en discontinuo y discontinuo‐alimentado utilizando ambas cepas. En todas las condiciones ensayadas los niveles de actividad fueron mayores que los obtenidos previamente en matraz Erlenmeyer, alcanzando la actividad máxima (30 U/ml) con la cepa Muts operando en una estrategia con sorbitol como co‐sustrato durante cultivo en discontinuo alimentado. La caracterización cinética de la proteína recombinante mostró una enzima mejorada con una eficacia catalítica aparente más elevada que la enzima nativa (~ 8 veces) para todos los sustratos ensayados (ésteres de p‐nitrofenol, glicerol y colesterol). Ni el mayor nivel de N‐glicosilación ni la presencia de residuos de metionina oxidados en la región de unión al sustrato de OPE* parecen ser responsables de esta mejora. Estudios de dicroísmo circular mostraron cambios en sus espectros, pero el análisis de los datos (método K2d de DichroWeb) dio como resultado un contenido idéntico en hélices α (0,46) y láminas β (0,23) para ambas proteínas indicando la ausencia de cambios en su estructura secundaria. Ahora bien, la principal diferencia en ellas se encontró en la secuencia N‐terminal de la OPE* que contenía 6‐8 residuos más que OPE. Estos residuos procedían del vector utilizado para la expresión de la proteína y del procesamiento ineficiente del factor α de Saccharomyces cerevisiae utilizado para la secreción. Esto afecta al estado de agregación detectado en OPE* (inferior a la descrita en OPE) lo que mejora su eficiencia catalítica...

Resumen (otros idiomas)

Lipases and esterases are versatile biocatalysts and the most used kind of enzymes for biotechnological purposes. Ophiostoma piceae produces a sterol esterase (OPE) with high affinity on triglycerides and sterol esters that is able to hydrolyse efficiently natural mixtures of these compounds from wood extractives. Due to these properties, the use of this enzyme has been proposed to decrease the pitch deposition problem in hardwood and softwood pulping. The mature protein sequence of OPE has been expressed successfully in Mut+ and Muts Pichia pastoris strains, which differ in their ability for metabolizing methanol as inducer of expression, resulting in higher levels of activity than those obtained in O. piceae Erlenmeyer cultures. In addition, the production of recombinant enzyme (OPE*) was scaled to bioreactor operating in batch and fed‐batch processes using both strains. In all the conditions assayed the activity levels were higher than those obtained in Erlenmeyer flask, reaching the maximum activity (30 U/mL) with Muts strain operating in a sorbitol co‐feeding strategy during fed‐batch cultivation. The kinetic characterization of the recombinant protein showed an improved enzyme with higher apparent catalytic efficiency than the native enzyme (~8‐fold) for all the substrates assayed (p‐nitrophenol, glycerol and cholesterol esters). Neither the greatest level of N‐glycosylation nor the presence of oxidized methionine residues in the substrate‐binding region of OPE* seem to be responsible of this improvement. Circular dichroism studies showed changes in their spectra but data analysis (K2d method from DichroWeb) resulted in an identical content of ‐helix (0.46) and ‐sheet (0.23) for both proteins, so no changes in their secondary structure were revealed. The main difference was found in the N‐terminal sequence of OPE* which contained 6‐8 more residues than OPE. These were derived from the vector used for the protein expression coupled with an inefficient processing of the ‐mating factor pre‐propeptide from Saccharomyces cerevisiae used for secretion. This affect the aggregation state detected in OPE* (lower than the reported in OPE) improving its catalytic efficiency..

Item Type:Thesis
Additional Information:

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología III, leída el 22-01-2016

Directors:
DirectorsDirector email
Munilla Morán, Roberto
Uncontrolled Keywords:Enzimas
Palabras clave (otros idiomas):Enzymes
Subjects:Medical sciences > Biology > Biotechnology
ID Code:36377
Deposited On:14 Mar 2016 13:29
Last Modified:10 Dec 2018 15:30

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