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Caracterización de proteína-fosfatasas de tipo 1 de Leishmania infantum y estudio mediante RNA-Seq de las alteraciones en la expresión génica diferencial inducidas en líneas knock-in

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Degayón Cortés, María Angélica (2018) Caracterización de proteína-fosfatasas de tipo 1 de Leishmania infantum y estudio mediante RNA-Seq de las alteraciones en la expresión génica diferencial inducidas en líneas knock-in. [Thesis]

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Abstract

Leishmania infantum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) es el agente causal de la leishmaniosis visceral en la cuenca mediterránea, donde el perro es el reservorio principal. La infección se transmite al hospedador mamífero por la picadura de dípteros de la subfamilia Phlebotominae. El ciclo biológico del parásito es digenético, y en él se alterna un estadío extracelular móvil o promastigote, que se desarrolla en el hospedador invertebrado a su forma intracelular o amastigote, que se multiplica en el interior de fagocitos del hospedador mamífero. La secuenciación de los genomas de las principales especies de Leishmania, publicada entre 2005 y 2007, y el desarrollo de técnicas de alto rendimiento como los microarrays de ADN, la proteómica cuantitativa y más recientemente, las metodologías basadas en la secuenciación masiva, han permitido llevar a cabo un análisis exhaustivo de los perfiles de expresión génica del parásito a lo largo de su ciclo biológico, con el fin de hallar posibles factores de virulencia implicados en su patogenicidad y/o posibles dianas terapéuticas y candidatos vacunales. En un estudio de transcriptómica comparativa llevado a cabo en el laboratorio de Parasitología Molecular del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC) se describió que los genes LinJ.34.0840 y LinJ.15.0240, que codifican proteína-fosfatasas 1 (PP1), están diferencialmente expresados en promastigotes de L. infantum extraídos directamente del tubo digestivo del vector Phlebotomus perniciosus. Aún habiéndose puesto de manifiesto en diversos estudios la importancia del estado de fosforilación proteico, durante los procesos de diferenciación del parásito, la funcionalidad concreta de las PP1 en Leishmania spp. es desconocida, al igual que las vías de señalización intracelular. Por este motivo, se decidió llevar a cabo la caracterización de estas proteínas en el desarrollo de esta tesis doctoral, realizada en dicho laboratorio. Aproximadamente un tercio de las proteínas de los organismos eucariotas se regulan por fosforilación. Las proteína-fosfatasas son las enzimas responsables de eliminar los ésteres de fosfato de estas proteínas. De acuerdo a su especificidad de sustrato las proteína-fosfatasas se pueden clasificar en dos sub-grupos: tirosina-fosfatasas (PTP) y serina/treonina-fosfatasas (STP). Las PP1 son STP y constituyen la familia más importante de proteína-fosfatasas en términos de diversidad de sustrato. Cada holoenzima de PP1 está compuesta por una subunidad catalítica y una subunidad reguladora. La subunidad catalítica de las PP1 representa una de las proteínas más conservadas en los organismos eucariotas, con una identidad de secuencia aproximada del 70% y un tamaño molecular comprendido entre 35 y 38 kDa. Las PP1 actúan de una manera muy específica y estrictamente regulada, dada su capacidad para formar complejos con un gran número de subunidades que controlan su localización, actividad y especificidad de sustrato. En los organismos vertebrados se han identificado cerca de 200 subunidades reguladoras o proteínas de interacción con PP1 (PIP). Estos complejos dan lugar a un conjunto diverso de holoenzimas con actividad dirigida a distintos sustratos y mecanismos de regulación propios. Esto explica la diversidad de funciones en las que participan las PP1: transcripción génica, ciclo celular, traducción, metabolismo, organización del citoesqueleto, regulación de transportadores, etc. El objetivo fundamental de esta tesis doctoral es la caracterización de la PP1 codificada por el gen LinJ.15.0240 (PP1-240) y del cluster de PP1 localizado en el cromosoma 34 (LinJ.34.0820, LinJ.34.0830, LinJ.34.0840, LinJ.34.0850) de L. infantum (cluster PP1C-34). Dicha caracterización incluye el estudio de la estructura primaria, el análisis de la expresión génica en los diferentes estadíos del ciclo biológico del parásito, el estudio de la localización subcelular y el estudio de las alteraciones en la expresión génica diferencial en líneas de promastigotes axénicos knock-in, es decir, transfectantes estables que sobre-expresan de forma constitutiva PP1-240 o el cluster PP1-34...

Resumen (otros idiomas)

Leishmania infantum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) is the causative agent of visceral leishmaniasis in the Mediterranean Basin, where dogs are the main reservoir. The infection is transmitted to the mammalian host by the bite of dipteran of the subfamily Phlebotominae. The life cycle of the parasite is digenetic and two stages alternate: the motile promastigote stage which develops in the invertebrate host and the non-motile amastigote stage, which multiplies within phagocytes of the mammalian host. Genome sequencing of the main Leishmania species was published between 2005 and 2007, and the development of high-throughput techniques, such as DNA microarrays, quantitative proteomics, and more recent methods based on next generation sequencing, have made exhaustive analysis of gene expression profiles of the parasite possible throughout the life cycle. This has been performed in order to find possible virulence factors involved in pathogenicity and/or possible therapeutic targets and vaccine candidates. In a previous comparative transcriptomics analysis performed in the laboratory of Molecular Parasitology of the Biological Research Center (CSIC), differential expression of the genes LinJ.34.0840 and LinJ.15.0240 encoding protein phosphatases 1 (PP1) was described in promastigotes isolated from the vector Phlebotomus perniciosus. Even though it hasbecome clear that the phosphorylation status of protein is remarkable during the differentiation processes of the parasite, funcionality of PP1 proteins from Leishmania spp.is not known accurately so far, as well as the signalling pathways in general. For thisreason, characterization of these proteins was proposed to develop this doctoral thesis, which has been carried out in the laboratory mentioned. Approximately one third of proteins of eukaryotic organisms are regulated by phosphorylation. Protein phosphatases are the enzymes responsible for eliminating phosphate esters from these proteins. According to their substrate specificity, protein phosphatases can be classified in two sub-groups: tyrosine phosphatases (PTP) and serine/threonine phosphatases (STP). PP1s are STP and constitute the most important family of protein phosphatases in terms of substrate diversity. Each PP1 holoenzyme is composed by a catalytic subunit and a regulatory subunit. The PP1 catalytic subunit is one of the most conserved proteins among eukaryotic organisms and has an approximate sequence identity of 70% and a molecular size comprised between 35 and 38 kDa. PP1s act in a very specific and strictly regulated mode due to their ability to form complexes with a great number of subunits that control their location, activity and substrate specificity. About 200 PP1 regulatory subunits or interaction proteins have been identified in vertebrate organisms. This explains the diversity of functions in which PP1 are involved: transcription, cell cycle, translation, metabolism, organization of the cytoskeleton, regulation of transporters, etc. The main objective of this doctoral thesis is characterization of the PP1 encoded by the gene LinJ.15.0240 (PP1-240) and the PP1 cluster located on chromosome 34 (LinJ.34.0820, LinJ.34.0830, LinJ.34.0840 and LinJ.34.0850) of L. infantum (cluster PP1-34). Said characterization includes the analysis of the primary structure, the analysis of gene expression in the main stages of the life cycle of the parasite, the study of the sub cellular localization and the study of the global alterations of differential gene expression in knock in axenic promastigote lines. In other words, stable transfectants that constitutively overexpress PP1-240 or cluster PP1-34...

Item Type:Thesis
Additional Information:

Tesis de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria, Departamento de Sanidad Animal, leída el 19/06/2017

Directors:
DirectorsDirector email
Larraga Rodríguez de Vera, Vicente
Alonso Ayala, Ana María
Alcolea Alcolea, Pedro José
Uncontrolled Keywords:Leishmaniosis visceral, Leishmania infantum, Zoonosis
Palabras clave (otros idiomas):Visceral leishmaniasis, Leishmania infantum, Zoonoses
Subjects:Medical sciences > Medicine > Communicable diseases
Medical sciences > Veterinary > Parasitology
ID Code:50032
Deposited On:14 Nov 2018 09:58
Last Modified:14 Nov 2018 09:58

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