Publication: Análisis molecular de las proteínas virales implicadas en la transmisión por pulgones del virus de la Sharka (Plum pox virus)
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2000
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Abstract
En el presente trabajo de tesis se ha abordado el estudio de las proteínas virales denominadas proteína de la cápsida (CP) y factor de adquisición (HC) como factores implicados en el proceso de transmisión de potyvirus por pulgones El mecanismo molecular de transmisión parece basarse en la interacción entre ambas proteínas, así como entre el HC y el estilete del pulgón, de modo que el HC actuaría a modo de “puente” entre la partícula viral y el vector.
Se emplearon dos aislados del virus de la Sharka (Plum Pox Virus, PPV) denominados PPV 5.15 y PPV 3.3 caracterizados como transmisible y no transmisible por pulgón, respectivamente. La CP de PPV 3.3 presenta una deleción en su extremo amino terminal que afecta a un triplete aminoacídico (DAG) que parece estar implicado en su interacción con el HC. Asimismo, se comprobó la no transmisibilidad de PPV R3-NAT, aislado obtenido en laboratorio a partir de una secuencia de genoma completo de PPV Rankovik y en cuya CP se reproduce la deleción encontrada en PPV 3.3.
La interacción in vitro de la CP de PPV 3.3 con un HC heterólogo del virus Y de la patata (PVY) fue puesta de manifiesto en trabajos anteriores de transmisión en sistemas artificiales de membrana. Esta interacción se ha demostrado ahora nuevamente en el caso de PPV R3-NAT. Este hecho es discutido en relación al reconocimiento por parte del HC heterólogo del motivo DAG alterado o bien de un segundo motivo funcional de la CP que podría actuar de forma alternativa en determinadas condiciones.
La interacción de la CP de PPV 3.3 con su HC homólogo así como con el HC de PPV 5.15 se ha comprobado in vitro, en sistemas de interacción en membrana de nitrocelulosa. Este resultado indica que la CP alterada de PPV 3.3 es capaz de unirse en condiciones artificiales al HC.
Se ha realizado una predicción de plegamiento para la CP de PPV que nos ha permitido obtener información acerca de la disposición espacial de los residuos implicados en la transmisión por pulgones, así como del efecto estructural que podría tener la deleción de quince residuos aminoacídicos que presenta la CP de PPV 3.3 en su extremo amino terminal.
El análisis de la secuencia del HC de PPV 3.3 y PPV 5.15 con el fin de comprobar la existencia de posibles alteraciones que afectasen al proceso de transmisión del primero, no ha revelado diferencias significativas entre ambos aislados, si bien los clones con las secuencias codificadoras del HC denotan una heterogeneidad que manifiesta una estructura poblacional que se ajusta a un modelo de cuasiespecie.
Secuencias codificadoras del HC de PPV 3.3 y 5.15 se intercambiaron por la correspondiente en clones de genoma completo de PPV Rankovik. En los casos en que las construcciones presentaron la secuencia del HC de PPV 5.15 la transmisión se vio incrementada con respecto al clon original que contiene la secuencia del HC de PPV Rankovik. La diferencia de transmisión podría radicar en estos residuos. Por otra parte, clones de PPV Rankovik con la deleción en la CP en los que también se sustituyó la secuencia del HC por la del HC de PPV 5.15 no fueron transmitidos por pulgones en experimentos de planta a planta. Este resultado indica que, si bien in vitro la CP de PPV con la deleción en su extremo amino terminal es capaz de interaccionar con un HC homólogo, en condiciones in vivo la transmisión no tiene lugar al verse afectada por la deleción presente en la CP.
En la línea de estudio de la transmisión heteróloga en potyvirus se realizaron quimeras del genoma PPV Rankovik en donde se sustituyó la región codificadora del HC por la correspondiente de los aislados PVY 0AT (transmisible por pulgones) y PVY 0NAT (no transmisible). Las construcciones, designadas como pQ-0AT y pQ-0NAT, resultaron infectivas en planta si bien no se transmitieron por pulgones. Por tanto, el HC de PVY, que resulta funcional en la transmisión de PPV 3.3 in vitro, no es capaz de promover la transmisión de PPV Rankovik en condiciones que simularían a las de la naturaleza, como serían las quimeras.
Por otra parte, se ha conseguido por primera vez la purificación parcial del HC de PPV gracias a la obtención previa de anticuerpos policlonales frente a esta proteína que nos han permitido el seguimiento de la misma durante el proceso de purificación.