Publication: Caracterización de la congelabilidad y mejora de los diluyentes de crioconservación espermática en porcino ibérico
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2012-01-19
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Universidad Complutense de Madrid, Servicio de Publicaciones
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Abstract
El cerdo Ibérico es una raza autóctona española en la que quedan englobadas diferentes variedades y estirpes de cerdos de la península Ibérica y sus islas. Su censo se ha visto disminuido notablemente desde la década de los 50, debido a factores como la peste porcina africana, el cambio en la estructura productiva y el sobrecruzamiento con razas más prolíficas como el Duroc Jersey, usándose mayoritariamente solo las variedades Ibéricas con mejores índices reproductivos y productivos. Esto hace que cada vez se utilicen menos, determinadas variedades, lo que causa la pérdida de variabilidad genética intrínseca de esta raza. Para conservar esta variabilidad, una de las técnicas actuales más utilizadas es la crioconservación espermática. Esta técnica está bien tipificada y es de fácil repetibilidad entre laboratorios, pero en la que existe el problema de la selección de los animales destinados para la conservación de su genética. Esta selección es un problema porque existe una susceptibilidad individual al proceso de congelación espermática en la especie porcina, encontrándose animales cuyos espermatozoides congelarán bien y otros que no. Además otro problema del proceso de crioconservación es que los diluyentes usados para la congelación, no han sufrido modificaciones en más de 20 años y además, durante este proceso se desecha una parte fundamental del eyaculado, el plasma seminal. Los objetivos de este trabajo han sido la caracterización bioquímica y funcional del eyaculado de cerdo Ibérico y el estudio de su congelabilidad, la determinación precoz de machos por su congelabilidad usando el ChemSensor, la determinación del diluyente más adecuado para la crioconservación espermática del cerdo Ibérico, así como el estudio del efecto de la inclusión del plasma seminal en el proceso de crioconservación para tratar de conservar el eyaculado completo.Para el estudio de la congelabilidad, se valoraron post-descongelación 37 eyaculados de cerdos Ibéricos de distintas variedades, teniendo en cuenta su viabilidad y motilidad total para su clasificación. Dichos resultados se correlacionaron con el perfil obtenido del análisis de los compuestos volátiles del semen, de la composición lipídica de la membrana del espermatozoide y del plasma seminal, así como de la composición proteica del plasma seminal. Para cada uno de los casos se determinaron 2 grupos de congelabilidad, buenos y malos congeladores, obteniendo solo diferencias significativas en el caso de las proteínas seminales, pudiéndose relacionar un mayor porcentaje de las proteínas de 15-kDa con animales que presentan una buena congelabilidad espermática. En cuanto a la diferenciación precoz de los animales por su congelabilidad espermática, se obtuvieron buenos resultados en la determinación entre los dos grupos de congelabilidad (buenos y malos congeladores). Observándose que el uso del semen completo para la discriminación, es la manera más fiable de diferenciar los eyaculados y aunque las distancias de separación encontradas entre los dos grupos de congelabilidad, no eran significativas, al tener un número tan bajo de réplicas se podrían considerar adecuadas. Para la determinación del diluyente más adecuado para la crioconservación espermática del cerdo Ibérico, se compararon tres tipos de diluyentes basados en tres técnicas diferentes según autores: Westendorf et al., 1975; Pursel y Johnson, 1975 y Thilmant, 1997, siendo éste último el diluyente de congelación que recomienda la FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nationes, 1998) para la conservación de recursos zoogenéticos porcinos. Y completando este experimento se evaluó el efecto de la inclusión del Orvus es Paste en el diluyente I y II (Thilmant, 1997) o solo en el diluyente II (Westendorf et al., 1975 y Pursel y Johnson, 1975). En los resultados obtenidos se observó que el diluyente de Westendorf et al., 1975 (Lactosa-yema de Resumen huevo) con Orvus es Paste solo en el diluyente II era el medio de congelación más adecuado para la crioconservación de espermatozoides de cerdo Ibérico. Asimismo, este mismo diluyente se usó para investigar el efecto de la inclusión del plasma seminal en el medio de congelación, sustituyendo el agua de dilución por diferentes porcentajes de plasma seminal (0%, 10%, 25%, 50%, 75% y 100%). Los resultados obtenidos mostraron que por encima de un 25% de plasma seminal en el medio, la osmolaridad de este se elevaba notablemente, produciendo un daño sobre las membranas de los espermatozoides. Además se observó que el diluyente con un 25% de plasma seminal mantenía durante más tiempo las características óptimas de los espermatozoides, determinándose un efecto protector del plasma seminal a lo largo del tiempo de incubación y siendo solo significativo cuando el plasma seminal se encontraba durante el proceso de congelación y no solo durante la descongelación. Los resultados de este trabajo indican que es posible mejorar la crioconservación espermática del cerdo ibérico, tanto usando un diluyente adecuado, como incorporando un 25% de plasma seminal a dicho medio, así como seleccionando previamente aquellos machos que vayan a congelar bien por medio del ChemSensor. Asimismo se ha observado que mediante el estudio de diferentes compuestos del eyaculado, la resistencia al proceso de congelación esta más relacionada con las proteínas del plasma seminal, que con la composición en ácidos grasos de la membrana del espermatozoide.
The Iberian pig is an autochthonous Spanish breed that is subsumed in the different varieties and strains of pigs from the Iberian Peninsula and their islands. Its census has been reduced significantly since the 50's decade, due to factors such as African Swine Fever, the change in production structure and the crossover with prolific breeds such as Duroc Jersey, and being used predominantly Iberian strains with better reproductive and productive rates. This provoked a decrease in the use of certain varieties or strains, causing the loss of inherent genetic variability in this breed. To preserve this variability, the most used technique is the sperm cryopreservation. This technique is well characterized and it is easily reproducible between laboratories, but exist a problem according to the selection of animals destined for genetic conservation. This selection is a problem because there is individual susceptibility to the freezing process between boars. There are animals whose sperm freezes well and others not. In addition another problem is that the diluents used for sperm cruopreservation have not been modified in over 20 years, and also during this process a fundamental part of the ejaculate, the seminal plasma, is discarded, The aims of this work have been the biochemical and functional characterization of the Iberian pig ejaculated and study of its freezability, the early identification of males by its freezability using the ChemSensor, determination the most appropriate diluent for sperm cryopreservation of Iberian pig, and the study of the effect of the inclusion of seminal plasma in these diluents to try to preserve the whole ejaculate. To study the freezability 37 ejaculates of different strains of Iberian pigs were assessed post-thawing taking into account the viability and total motility for the classification. And these results were related with the profile obtained from the analysis Summary of volatile compounds in semen, the membrane lipid composition of sperm and seminal plasma and the seminal plasma protein composition. For each of the cases were determined 2 groups of freezability, good and bad freezers, obtaining significant differences only in the case of seminal proteins, being able to relate the 15-kDa protein to animals with a good freezability. It was obtained good results in early differentiating between the two groups of freezability (good and bad freezers). It observed that using the whole ejaculate for the discrimination is the most reliable way of discriminating the ejaculates, although the separation distances found between the two groups of freezability, were not significant, it should be noticed that a low number of replicas were used, hence could be considered as an appropriate discriminatory test. To determine the most appropiate media for sperm cryopreservation of Iberian pig, three different types of diluents were compared. These diluents were based on three different techniques according to following authors: Westendorf et al., 1975; Pursel and Johnson, 1975 and Thilmant, 1997. Being this last one the freezing diluent recommended by the FAO (1998) for the conservation of animal genetic resources swine. Completing this experiment the effect of including Orvus es Paste in the diluent I and II (Thilmant, 1997) or only in the diluent II (Westendorf et al., 1975, Pursel and Johnson, 1975) was studied. It was observed that the Diluent Westendorf et al., 1975 (Lactose-egg yolk) with Orvus es Paste only in the diluent II was the most appropriate freezing media for cryopreservation of sperm of Iberian pig. Furthermore this same diluent was used to investigate the effect of the inclusion of seminal plasma in the freezing medium, replacing the dilution water by different percentages of seminal plasma (0%, 10%, 25%, 50%, 75% and 100%). The results showed that over 25% of seminal plasma in the medium resulted in damage to sperm membranes by the high osmolarity in the media. Furthermore we observed that the diluent with 25% of seminal Summary plasma maintained for a longer time the optimum characteristics of the sperm, determining a protective effect of seminal plasma during the incubation time and being only significant when the seminal plasma was added during freezing and thawing process, but not only during thawing. The results of this study indicate that it is possible to improve sperm cryopreservation of Iberian Pig, either using an appropriate freezing media, such as incorporating 25% seminal plasma in that medium, as well as pre-selecting those males that will freeze well through ChemSensor. In addition, we found that the greatest resistance to freezing process is more concerned with seminal plasma proteins that with the fatty acid composition of the sperm membrane.
Description
Tesis de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria, Departamento de Medicina y Cirugía Animal I, leída el 22-07-2011