Publication: Estudios del ciclo vesicular en neuronas granulares de cerebelo de rata
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2014-04-22
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Universidad Complutense de Madrid
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Abstract
Las sinapsis químicas son responsables de la transmisión de la información en el sistema nervioso central de mamíferos; estas se caracterizan por la presencia de pequeñas vesículas que contienen moléculas de neurotransmisor, denominadas vesículas sinápticas (SVs). (Sudhof, 2012). La llegada de un potencial de acción al compartimento presináptico, induce un influjo de calcio mediado por los canales de calcio activados por voltaje (CCAV) que promueve la fusión de estas SVs con la membrana plasmática, lo que desencadena la liberación del neurotransmisor a la hendidura sináptica (Sudhof, 2004). Una vez en el espacio extracelular, las moléculas de neurotransmisor se unen a sus receptores postsinápticos, activándolos (Attwell y Gibb, 2005), y propagando de este modo el impulso nervioso a través de la red neuronal. Los neurotransmisores liberados pueden activar también receptores presinápticos que, a su vez, modulan la liberación de neurotransmisor. Las regiones del axón donde el neurotransmisor es liberado, conocidas como zonas activas (ZA), contienen una elevada densidad de CCAV rodeados por una intrincada de red de proteínas que interaccionan entre ellas, posicionando las SV's junto a los canales de calcio; estas proteínas forman la denominada Citomatriz de la Zona Activa (CAZ) (Gundelfinger y Fejtova, 2012; Sudhof, 2012). Estas características justifican la elevada sensibilidad y la fina regulación de los procesos de fusión de las SVs. Durante rondas de estimulación sucesivas, las sinapsis se ven obligadas a reutilizar su material vesicular para mantener la fidelidad de la transmisión sináptica, codificada en términos de frecuencia. El concepto del ciclo de las vesículas sinápticas se origina a partir de este escenario, en el que el reciclamiento local de las vesículas sinápticas por medio de la endocitosis y la re-acidificación puede plantearse como el paso limitante de la eficacia sináptica (Betz y Angleson, 1998; Sudhof, 2004). El ciclo de las SV́s comprende cuatro pasos secuenciales. En un primer momento, las SVs establecen un contacto físico con la membrana presináptica, anclándose a ella; es aquí donde las vesículas serán preparadas para su liberación, adquiriendo plena competencia exocitótica. Más adelante, la entrada de calcio inducirá la fusión (exocitosis) de las vesículas con la membrana presináptica. La fracción lipídica que corresponde a las SV's será reciclada por mecanismos de endocitosis compensatoria y posteriormente, después de rellenarse con nuevas moléculas de neurotransmisor, estas vesículas podrán ser empleadas en una ronda de exocitosis posterior. Haciendo uso de una estrategia dual de imagen en célula viva, técnicas de microscopía electrónica y experimentos farmacológicos, hemos caracterizado dos pasos diferentes del ciclo de las vesículas sinápticas en neuronas granulares de cerebelo en cultivo. Los experimentos de VGluT-pHluorina y de FM1-43, combinados con inmunocitoquímica post-hoc, permiten analizar muestras altamente pobladas de respuestas sinápticas individuales. Respecto a los mecanismos de endocitosis, encontramos que la eficacia sináptica, en términos de reutilización de las SVs, es limitada durante las estimulaciones de alta intensidad debido a la coexistencia de mecanismos eficaces e ineficaces de reciclamiento. Las rutas de reciclamiento ineficaz (que comparten algunas características con la endocitosis masiva) (Clayton y Cousin, 2009), se inician a consecuencia de la exocitosis masiva que tiene lugar durante periodos de elevada actividad neuronal y conllevan las acumulación de endosomas no liberables en el terminal presináptico. Además, hemos encontrado que estas formas de endocitosis no vesicular muestran una regulación paralela a la maduración del cultivo, desapareciendo las formas ineficaces de reciclamiento en estadios tardíos del cultivo de neuronas. Mientras que la actividad GTPasa de la dinamina no es requerida para la fisión de estas estructuras de tipo endosomal, la interacción con la membrana de la mencionada enzima parece ser crucial para este proceso. De forma acorde a lo esperado, la inhibición de la dinamina resultó en el bloqueo de las formas eficaces de reciclamiento. La fosfatasa calcineurina parece estar implicada en el reciclamiento vesicular en mayor medida que en el reciclamiento endosomal. Puesto que la eficacia de reciclamiento aumento de forma directamente proporcional a la inmunorreactividad de importantes proteínas presinápticas, nosotros proponemos que la eficacia sináptica, en términos de reciclamiento vesicular, es un marcador de la madurez sináptica (Bartolome-Martin et al., 2012). Por otro lado, hemos caracterizado parcialmente los defectos exocitóticos que subyacen a los fenómenos de inhibición presináptica mediados por endocannabinoides. (Kreitzer y Regehr, 2001). Encontramos que la activación prolongada del refceptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1R), inhibía la exocitosis de las vesículas sinápticas por medio de una reducción en los niveles de cAMP. Al analizar sinapsis individuales, encontramos que algunas de ellas eran completamente renuentes a la liberación vesicular tras la activación del receptor CB1R, lo que nos dio pie a clasificarlas como sinapsis silentes. Este efecto no apareció asociado a la reducción dce la entrada de calcio por CCAV, y se pudo prevenir mediante la preincubación con forskolina. La reducción de los niveles de cAMP parece operar por una disminución en los niveles de actividad de la proteína EPAC, más que por mecanismops dependientes de PKA. El análisis ultraestructural reveló que la activación de CB1R inducía una retracción de las SVs más cercanas a la membrana de la ZA. En el presente estudio se demuestra también, que la susceptibilidad al silenciamiento sináptico mediado por CB1R viene determinada por los niveles de RIM1α en sinapsis individuales. A la luz de estos resultados, proponemos que la activación del CB1R ejerce un efecto inhibitorio heterogéneo sobre distintas sinapsis, induciendo una ausencia completa de exocitosis en un conjunto de terminales presinápticos. Este hecho puede estar relacionado con la LTD mediada por cannabinoides.
[ABSTRACT]Synaptic transmission in the mammalian nervous system is mainly based on chemical synapses. These synapses contain a cluster of small vesicles that are filled up with neurotransmitter molecules, referred to as synaptic vesicles (SVs) (Sudhof, 2012). Upon the arrival of an action potential to the presynaptic compartment, calcium influx through voltage gated calcium channels (VGCC) promotes the fusion of these SVs with the plasma membrane, leading to the release of the neurotransmitter into the synaptic cleft (Sudhof, 2004). Once in the extracellular space neurotransmitter molecules bind to postsynaptic receptors (Attwell y Gibb, 2005), propagating, in this way, the nerve impulse through neuronal networks. The released neurotransmitter can also activate presynaptic receptors which, in turn, modulates neurotransmitter release. Axonal sites of neurotransmitter release, also known as Active Zones (AZs), contain a high density of VGCC surrounded by a complex network of proteins that interact among them, positioning SV's in the vicinity of calcium channels; these proteins make up the so called cytomatrix at the active zone (CAZ) (Gundelfinger y Fejtova, 2012; Sudhof, 2012). All together, these features justify the high sensitivity and the exceptionally tight regulation of SV fusion. However, during trains of repetitive stimulation neurons have to reuse their vesicular content to sustain the fidelity of synaptic transmission. The concept of the synaptic vesicle cycle emerges from this scenario, in which local vesicular recycling through endocytosis and re-acidification can be understood as the limiting step of the synaptic efficiency (Betz y Angleson, 1998; Sudhof, 2004). SV cycle comprises four sequential steps. At a first stage, SV's establish a physical contact and dock to the presynaptic plasma membrane; here, the vesicles will be primed, acquiring full exocytic competence. Later on, calcium-triggered exocytosis gives rise to the fusion of the vesicles with the presynaptic plasma membrane. The lipidic moiety corresponding to the SV`s will be retrieved through compensatory endocytosis, and then, after refilling, the vesicles will be able to participate in a subsequent round of exocytosis. By making use of a dual strategy in live cell imaging, electron microscopy techniques, and pharmacological experiments, we have characterized two different steps of the synaptic vesicular cycle in cultured cerebellar granule neurons. VgluT-pHluorin and FM1-43 experiments combined with correlative post-hoc immunocytochemistry, allowed us to study large populated samples of individual nerve terminals. Regarding endocytic mechanisms we have encountered that synaptic efficiency, in terms of SV reuse, is limited during strong neuronal stimulation due to the co-existence of effective and ineffective endocytic pathways. The ineffective endocytic pathways, which resemble some of the features of bulk endocytosis (Clayton y Cousin, 2009), are started up as a consequence of the massive exocytosis of SVs that takes place during high neuronal activity, and involve the accumulation of non-releseable endosomes at the presynaptic level. Moreover, we found that these forms of non-vesicular endocytosis showed a developmentally regulated switch towards efficient forms of SV retrieval at later maturational stages. Interestingly, while dynamin GTPase activity was not necessary for the scission of these endosomes, its interaction with the plasma membrane appeared to be crucial for this process. As expected, efficient forms of recycling were virtually abolished by dynamin inhibition. Calcineurin activity seemed to be participating in vesicular recycling to a higher extent than in endosomal recycling. As recycling efficiency scales up with the immunoreactivity of key synaptic proteins at the individual synaptic level, we propose that synaptic efficiency, in terms of SV reuse, is a hallmark of synaptic maturation (Bartolome-Martin et al., 2012). On the other hand, we have partially dissected the exocytic defects underlying the well established paradigm of cannabinoid-mediated presynaptic depression (Kreitzer y Regehr, 2001). We found that a prolonged activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R), strongly inhibited synaptic exocytosis by means of a drop in cAMP levels. When analyzing at the single synaptic level some of the puncta analyzed were completely reluctant to synaptic exocytosis after CB1R activation, which led us to classify them as silent synapses. This effect was not associated to a reduction in calcium entry through VGCC, and could be prevented by incubation with forskolin. This cAMP drop seemed to operate by EPAC-dependent rather than by PKA-dependent mechanisms. At the ultrastructural level, CB1R activation elicited a withdrawal of the SV closer to the plasma membrane at presynaptic active zones. We also demonstrate that the susceptibility to CB1R-mediated synaptic silencing was largely determined by the RIM1α content at individual nerve terminals. All together, we propose that CB1R activation exerts an heterogeneous inhibitory effect over different synapses, giving rise to a lack of exocytosis in a subset of presynaptic terminals. This fact could be related to cannabinoid mediated LTD.
Description
Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular IV, leída el 28-02-2014